1527年春，查理五世派遣一支军队，由波旁公爵率领，从米兰出发开赴罗马。5月，双方军队在罗马城下交战，波旁公爵战死。无人指挥的2万多名德国军队和西班牙军队纷纷哗变，他们拥进圣城，不分青红皂白地烧杀抢劫，无数珍贵的文物圣品被洗劫一空。查理五世在罗马城下的惨败增强了弗朗西斯一世夺取胜利的信心。6月，他派大军进入意大利，陆军占领米兰和帕维亚，舰队迫使热那亚倒戈屈服，接着，法将洛特列克率军南下，远征那不勒斯。在热那亚和威尼斯舰队的支援下，法军于1528年冬占领王国大部地区，包围了那不勒斯城。但就在胜利来临之际，风云突变：热那亚转向敌人方面，法国失去了制海权；鼠疫在军中流行，官兵大量死亡。弗朗西斯增兵无源，无法再战，只好与查理五世议和。根据1529年在康布雷签订的和约，弗朗西斯一世被迫放弃对意大利的主权要求，但法国保留了勃艮第。接着，查理五世又同克里门七世达成协议：克里门七世答应把那不勒斯授予查理五世；查理五世则保证派帝国军队去推翻新近成立的佛罗伦萨共和国，使美第奇家族得以复辟。
1527年8月18日法军占领意大利的帕维亚和热那亚
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