查理五世为天主教奉献了全部忠诚乃至狂热。他是宗教改革运动的激烈反对者，并企图建立一个“世界天主教帝国”。1521年，查理五世以皇帝身份传唤马丁·路德参加沃尔姆斯宗教会议（许诺保证路德的人身安全）。他在这次会议上宣布路德及其追随者为非法（1521年沃尔姆斯敕令）。
1524年有鉴于德国爆发农民起义而新教诸侯组成了施马尔卡尔登联盟，查理五世决定把德意志事务交给弟弟斐迪南（即日后的斐迪南一世）全权办理。
1545年特伦特公会议的召开宣告了欧洲天主教势力反对宗教改革的浪潮的开始。查理五世决心惩罚德意志的新教王公。1546年查理五世与施马尔卡尔登联盟开战。在战争的第一阶段（1546年—1548年）他打败了萨克森选侯约翰·腓特烈, 并将投降的黑森侯爵（慷慨的）腓力一世监禁起来（1547年—1552年）。然而，他是先胜后败。新的战事于1552年爆发后，查理五世遭到一系列失利，遂与诸侯签订1555年奥格斯堡宗教和约。
