lncrna引物设计（CRISPR/Cas9敲除LncRNA或者外显子的效率是多少？）

经常会有小伙伴问用CRISPR/Cas9系统敲除整个外显子或者lncRNA的效率是多少，和敲除片段的大小有关系吗？为了回答这个问题，在此和大家分享一篇验证这类敲除效率的文章。

文章题为“Characterization of Genomic Deletion Efficiency Mediated by Clustered Regularly Interspaced Palindromic Repeats (CRISPR)/Cas9 Nuclease System in Mammalian Cells”，2014年发表在JBC上，NCBI显示目前已经累计被引用154次。

为了研究CRISPR/Cas9介导的基因组片段敲除的效率，该文章设计了一系列的成对sgRNA用于敲除长度在1.3kb到1MB的基因组上的片段（图1）。这些片段有些位于外显子区，有些位于内含子区，也有部分位于基因间区。且涉及被编辑的基因都与细胞增殖无关。

图1. 成对sgRNA靶点设计

成对sgRNA设计，虽然有可能会将两个sgRNA中间片段敲除，但也可能在原位修复，不发生删除。为了检测出现的具体结果，在不同的靶点附近，作者设计了多对引物。

图2. 修复结果分析的引物设计

在开始检测该细胞是否有等位基因发生敲除时，利用了图2中上面的蓝色及红色两对引物，红色引物位于两个sgRNA之间，蓝色引物位于两个sgRNA之外。此时有三种情况，第一，如果红色引物PCR后跑DNA胶无条带，蓝色引物PCR有条带（如果中间片段没有被敲除，蓝色引物中间片段过长，PCR无法扩增出该产物），则说明是纯合子敲除。第二，如果红色引物PCR有条带，而蓝色引物PCR也有条带，则说明杂合子敲除。第三，如果红色引物PCR有条带，而蓝色引物PCR无条带，则说明没有发生敲除。

但是，对于红色引物PCR产物有条带，还有一种情况需要分析，即两个sgRNA中间片段是否发生了颠倒。于是作者又设计了图2中下面的绿色及紫色两对引物用于扩增sgRNA靶点及其附近序列，如果引物1,2和引物3,4分别PCR有条带则说明没有发生颠倒，如果引物1,3和引物2,4有条带则说明中间片段发生了颠倒。

图3. 成对sgRNA切除基因片段效率

17对sgRNA挑选出了1974个克隆，最终共检测了278个单克隆细胞株。按照等位基因进行分析，278株细胞有556个等位基因。149/556(26.8%)个等位基因中间片段被删除，72/556(12.9%)个等位基因中间片段发生了颠倒，剩余约60%在Cas9切割的位置原位修复，未导致删除。在做外显子敲除时，等位基因颠倒的情况也是可以考虑的一种基因编辑方式。从整体看，等位基因颠倒加上删除的比例接近40%。但是，对于lncRNA的敲除，由于不确定颠倒是否会失活其功能，因此lncRNA不建议使用颠倒的克隆用于后续实验。

按照细胞株进行分析，31/278(11.2%)的细胞为双等位基因删除细胞，2/278(0.7%)的细胞为双等位基因颠倒细胞。26/278(9.4%)的细胞其中一个等位基因删除，一个等位基因颠倒。61/278(21.9%)的细胞其中一个等位基因敲除，另外一个等位基因在Cas9切割的位置原位修复。39/278(14.1%)的细胞其中一个等位基因颠倒，另外一个等位基因在Cas9切割的位置原位修复，而两个等位基因既没有删除又没有颠倒的细胞比例为119/278(42.8%)（图3）。

在将所有数据统合后，文章进一步分析了敲除片段长度与敲除效率的关系（按照等位基因进行分析），得出结论，敲除效率与敲除长度呈负相关性（图4）。可以看到，当敲除片段在23kb以内时，敲除效率基本都在10%以上，甚至还有许多片段的敲除效率在20%乃至30%以上。

除去这些敲除效率的信息外，文章中还有一些值得留意的细节。第一，6/40(15%)双等位基因敲除细胞是精确删除的；27/87(31%)的单等位基因敲除细胞是精确敲除的。补充一下，目前认为野生spCas9的切割位点位于靶点的第17和18位中间，切割产生平末端，所谓精确敲除即两个cas9切割后的序列直接相连，中间没有缺失或者插入其他序列。第二，对于不是精确删除的细胞，由于两个平末端是被NHEJ修复方式修复的，往往会引入一些indel，这些indel的长度绝大部分集中在-10bp-0bp（负号代表删除，正号代表插入）。第三，对于双等位基因敲除细胞，其中部分进行一代测序发现，22/31(71%)的细胞两个等位基因中间的indel序列是完全相同的，9/31(29%)的细胞两个等位基因的indel片段不同。

如果将这里的第一点和第三点结合起来看，会发现NHEJ比较有趣的一些内容。比如，如此高的精确修复比例，说明NHEJ修复过程中有很大可能是不引入indel的。再比如，高比例的纯合子删除（indel相同）暗示NHEJ可能存在按照模板修复的可能性。

注：低阳性比例细胞筛选方法优化

对于删除超过1MB（1000kb）的片段，即在染色体层面删除基因组的大片段，这篇文章筛选的比例为4/339，略微超过1%。还有其他一些文章筛选后给出的比例基本都是1%。如此低的比例如果去筛选单克隆细胞株的话，是一个非常大的工作。并且，1%并不意味着100个细胞一定能筛到一个，被各种游戏厂商骗去抽过卡的同学可能更能理解什么叫非酋。因此，这里给大家介绍一个方法，可以在有限稀释的时候按照每孔5-10个细胞进行稀释，用流式细胞仪种细胞也按照每孔5-10个细胞进行接种。在这些孔中我们检测到有阳性细胞后，再用该孔细胞挑一次单克隆即可，第二次挑单克隆的阳性比例将直接上升到10%-20%。两种情况下，我们推荐采用上面介绍的方法：第一，敲除片段在1000kb以上；第二，敲除片段在1000kb以下，PCR验证有阳性细胞，但是单克隆挑选非常多次依然未筛选到阳性克隆。